作妖作福的肠道CP-文峰聊CNS
生物膜为癌细菌提供避难所
家族性腺瘤性息肉病（FAP）会导致结肠良性息肉。如果不治疗，FAP导致结肠癌高发病率。为了解息肉如何影响肿瘤形成，Dejea等人检查了FAP患者的结肠粘膜江湖丛谈,他们发现了含有致癌型大肠杆菌和脆弱拟杆菌的生物膜。戴景耀来自FAP患者的结肠组织表现出两种产生分泌性毒素的细菌基因的表达上调。小鼠研究表明，特定的细菌共同作用，会诱导结肠炎症和肿瘤形成。
摘要
散发性结直肠癌（CRC）的个体经常存在肠道微生物组成的异常;然而，与遗传性CRC的癌前病变相关的微生物群仍然大部分未知。我们研究了家族性腺瘤性息肉汤传信 病（FAP）患者的结肠粘膜，这些患者在生命早期发展为良性前兆病变（息肉）。我们确定了主要由大肠杆菌和脆弱拟杆菌组成的斑状细菌生物膜。对于编码分泌型芋螺毒（oncotoxins）的大肠杆菌毒素（colibactin）（基因clbB）和脆弱拟杆菌毒素（bft），高度富集在FAP患者的结肠粘膜。肿瘤倾向性小鼠结肠中大肠杆菌和产肠毒素的脆弱类杆菌，并且分泌的白细胞介素-17增多，同时结肠上皮中的DNA损伤更频繁，具有更快的肿瘤发病率和更高的死亡率借金姐妹。袖珍三姐妹这些数据表明结肠早期肿瘤与致瘤细菌之间有意想不到的联系。
结肠直肠癌（CRC）在全球非常普遍，并且通过积聚促进正常粘膜向腺癌转化的结肠上皮细胞（CEC）突变而发展。大约5％的CRC发生在遗传突变的个体中。家族性腺瘤性息肉病（FAP）是一种遗传性疾病，由APC肿瘤抑制基因中的种系突变引起密丽除疤膏。具有FAP的个体在向CRC过渡期出生时具有其第一次突变，并且随着体细胞突变积累，发展数百至数千个大肠息肉。在具有相同APC基因突变的家族中息肉形成的发生和频率变化很大，这表明其他因素在街道疾病发生过程中起重要作用，比如胃肠道微生物组成。
结肠含有数万亿的细菌，这些细菌通过致密的粘液层与结肠上皮分开。该粘液层通过限制细菌与上皮细胞的接触来限制粘膜炎症反应从而促进机体对外来抗原的耐受性。相反，细菌黏附于结肠粘液层，在一些情况下，生物膜形成反而促进慢性粘膜炎症。为了检验生物膜形成可能是遗传性结肠癌进展的早期事件的假设，我们收集FAP患者结肠切除术的粘膜。
我们最初筛选了5例FAP患者和1例青少年息肉综合征患者手术切除组织，接受结肠镜健康检查结肠活检标本作为对照（n= 20）。每个FAP患者通过沿结肠轴散布的粘液层表现出细菌侵入现象（图1A）。与散发性CRC患者中的连续粘膜生物膜不同，4/6的病人在手术切除的标本中出席那了70％区域以上的斑片状细菌粘液侵袭（平均长度150μm）。

图1荧光原位杂交（FISH）和FAP粘膜组织的微生物学培养分析。
通过额外的16种SrRNA探针进一步筛选具有细菌生物膜的标本以识别在散发性CRC的生物膜中检测到的主要的细菌种类;即Bacteroides /Prevotella，Proteobacteria，Lachnospiraceae和Fusobacteria最常见。值得注意的是，FAP生物膜主要由粘液侵袭性变形杆菌（?60％至70％）和类杆菌（10％至32％）组成。
FAP患者中直接接触宿主结肠上皮细胞的两种主要生物膜成员被鉴定出来是大肠杆菌和脆弱拟杆菌，且被证实具有潜在致癌性。大肠杆菌含有聚酮化合物合酶（PKS）基因毒性岛（编码基因负责该colibactin基因毒素的合成），能使氧化偶氮甲烷（AOM）处理的白细胞介素-10（IL-10 ） - 缺陷的小鼠发生DNA损伤。而产肠毒素的脆弱类杆菌（ETBF）增诱导ApcMin / +小鼠致癌。人类流行病学研究已经关联ETBF和PKS+大肠杆菌与炎性肠病和散发性CRC相关。我们培养来自25名FAP患者（每个患者两个息肉和两个正常组织）和23个健康个体（来自手术切除的粘膜样品或每个结肠镜检查对象的一个上行结肠活检和一个降结肠活检的冷冻粘膜组织）易装网。FAP患者的粘膜（68％）pks+大肠杆菌感染阳性，脆弱拟杆菌感染（60％），对照组分别为22％和30％ETBF（图1C）。值得注意的是，pks+大肠杆菌和ETBF粘膜联合发生率高于预期的发生率（52％），随机发生率为40.8％（见图1C）。健康对照组发现比预期多的粘膜复合感染（观察到22％比预期的6.6％高）（图1C）。对FAP患者粘膜生物膜进行激光捕获显微切割，通过聚合酶链反应（PCR）分析发现存在BFT和clbB致病基因，表明致癌亚型脆弱拟杆菌和大肠杆菌分别存在于与FAP上皮直接接触的粘液层中（图1D）。
FAP患者结肠中往往伴随中高频率的pks+大肠杆菌和ETBF共感染。为了证实两种肠道细菌和肿瘤发生的关系，我们使用了两种小鼠模型，致癌物AOM诱导的无菌性的结肠癌发病模型以及APC框移突变造成的结肠癌模型。AOM模型中，分别给小鼠移植单种肠道细菌以及两种细菌，去研究小鼠成瘤情况，过程中保持小鼠粪便细菌数直到15周后。结果两种细菌共感染情况下，成瘤率明显高于单细菌作用，两种模型系统中自发性结肠肿瘤发生率都非常低。（图2，A至C）。肿瘤发生需BFT的存在和大肠杆菌毒素存在，一旦bft基因和PKS毒性岛发生框移突变，肿瘤的发生率明显降低（图2A）。

图2通过pks +大肠杆菌和ETBF的共感染在CRC的小鼠模型中增加结肠肿瘤发生和死亡。
Apc MinD716/+小鼠一旦同时存在ETBF和PKS +大肠杆菌感染，体重会快速下降，死亡率明显上升。（P<0.0001）[80％的小鼠在8周后死亡，剩余20%在12周后死亡。相反妒后养成史，分别用ETBF或pks +大肠杆菌单一感染小鼠，15小周后仍然存活。ApcMin/+小鼠在双重细菌感染情况下发生肠道炎症，并形成更多数量的炎症。与肿瘤发生率一致的使组织病理学的数据，AOM小鼠模型中，双重细菌感染会使肠道增生以及粘膜微腺瘤的发生率。然而，组织病理学评分在单独感染和双重感染上只存在中等程度差异（4天至15周），因此总的炎症水平尚不能直接解释肿瘤的发生率，反而可能是炎症的类型，对于肿瘤的产生起到影响。（图3B）。为了确定炎症类型是否导致了肿瘤发生的差异，我们通过流式细胞术分析单细菌感染和多细菌感染情况下固有层浸润的免疫细胞的差异。结果发现在双感染情况下，固有层浸润了更多的B淋巴细胞，而T淋巴细胞（CD4，CD8，或γδT细胞）分布没有区别苍狼绝爱。髓系淋巴细胞总数并无差异。无论是感染早期急性炎症期（1周）还是3周后的慢性炎症期。

图3IL-17诱导的炎症是细菌驱动的肿瘤发生所必需的绝世倾情。
特别有趣的是IL-17被认为是Apc MinD716/+小鼠肿瘤发生的重要因素，因为bft，基因是双重细菌感染前提下还需要满足的条件。所以我们接下来再AOM模型中探索IL-17致瘤的作用。为了专门测试ETBF和pks +大肠杆菌共感染是影响早期结肠粘膜IL-17产生的重要因素，我们采用无菌C57BL / 6小鼠，使其单或共感染两种细菌，并通过流式细胞术分析先天性和适应性淋巴细胞亚群。结果受受双重细菌感染的小鼠获得性[T helper 17 (TH17)] and固有(particularly gdT17)T淋巴细胞都多于但细菌感染。（图3E）。尽管IL-17对于肿瘤发生是必需的（图3D），但单独的IL-17似乎不足以解释小鼠中的协同肿瘤发生，因为通过ETBF就可引起比较强的IL-17释放，但仅有微弱的结肠肿瘤发生（图2A）由于在图3C）中我们发现不同感染情况的B淋巴细胞浸润不同，所以设定不同感染会引起不同程度的IgA的释放，我们使用IgA酶联免疫吸附测定（ELISA）AOM模型细菌定值后4周收集的粪便。结果双重感染情况下产生更多的抗pks +大肠杆菌IgA孟津一高 ，而双重感染产生的抗ETBF IgA并不多余ETBF 单独感染。（图4A）。因此，双重感染实际上是ETBF增加了肠道对于pks +大肠杆菌的粘膜暴露。

图4ETBF增强pks +大肠杆菌定植和结肠上皮细胞DNA损伤。
即使实验条件控制下AOM小鼠粪便中的细菌总数一致，但是它们的黏附能力却存在差异。ETBF的存在实际上能促进 pks+ E. coli的黏附（图4B）。使得pks+ E. coli 存在于肠腔的水平更高变得更广。同时我们还使用Muc-2–producing HT29-MTX-E12----一种检测粘膜深度的方法，尽管单独的pks +大肠杆菌定植对粘液深度没有影响夏县吧 ，但单独定位ETBF单独或与pks +大肠杆菌共同显着降低了粘液深度，类似于用已知的人结肠粘蛋白降解细菌A. muciniphila定殖（图4C） 。这些结果表明通过ETBF降解粘液促进增强的pks +大肠杆菌定居俺混在农村，从而促进pks +大肠杆菌释放毒素colibactin，达到破坏正常粘膜DNA的效果。（图4D）相比，γ-H2AX免疫组织化学揭示了与pks +大肠杆菌和ETBF共结合的AOM小鼠的结肠上皮细胞中显着增强的DNA损伤（图4D）。
总结：
ETBF和pks +大肠杆菌通过两个不同但相辅相成的步骤促进增强的癌发生：（i）ETBF降解粘液能够增加pks +大肠杆菌粘附，诱导大肠杆菌毒素释放，增加结肠上皮细胞DNA损伤（图4D）;（ii）pks +大肠杆菌能存进ETBF释放IL-17，IgA,促进肠道炎症.其（图3，D和E）。
title:Patients with familial adenomatouspolyposis harbor colonic biofilmscontaining tumorigenic bacteria
doi:10.1126/science.aah3648